Pediatría
ISSN impreso:0120-4912
e-ISSN:2444-9369
DOI: 10.14295/rp.v57i1.497
Artíuclo de Revisión
Métodos diagnósticos moleculares en enfermedades neuromusculares y neurodegenerativas de origen genético
Molecular Diagnostic Methods in Genetic Neuromuscular and Neurodegenerative Diseases
Fernando Suárez-Obandoa,b,c Adriana Ordóñez-Vásqueza, Luisa Fernanda Suárez Ordóñeze, Juan Carlos Prietoa,d
a. Instituto de Genética Humana. Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Javeriana.
b. Servicio de Genética Hospital Universitario San Ignacio.
c. Servicio de Genética Instituto Roosevelt.
d. Servicio de Genética, Hospital La Victoria.
e. Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Javeriana.
Recibido: 4 de octubre de 2023 Aceptado: 19 de febrero de 2024
Cómo citar: Suárez-Obando F, Ordóñez-Vásquez A, Suárez Ordóñez LF, Prieto JC. Métodos diagnósticos moleculares en enfermedades neuromusculares y neurodegenerativas de origen genético. Pediatr.2024;57(1): e497.
Autor de correspondencia: Adriana Ordóñez-Vásquez. Correo electrónico: aordonez@javeriana.edu.co
Editor en Jefe: Álvaro León Jácome Orozco.
Resumen
El estudio etiológico de las enfermedades neuro genéticas requiere del diagnóstico molecular, para lo cual se necesitan diversas técnicas de análisis genético que deben ser conocidas por el médico tratante y a su vez, ser analizadas por el laboratorio, a la luz de la orientación clínica. La falta de conocimiento de las correlaciones entre los fenotipos y las pruebas adecuadas puede llevar a errores en el diagnóstico, dado que la técnica equivocada no identificaría la causa genética subyacente, confundiendo o aplazando el diagnóstico. Se presenta una revisión de las técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico neuro genético, ejemplos de correlaciones clínicas con técnicas específicas y tablas con los tipos de alelo relacionados con la confirmación diagnóstica. Esta revisión es de utilidad para la interpretación clínica y para el análisis e informe de resultados por parte de los laboratorios que realizan pruebas moleculares diagnósticas.
Palabras clave: Datos de Secuencia Molecular. Técnicas de Diagnóstico Molecular. Enfermedades Neuromusculares. Miopatías Estructurales Congénitas. Distrofias Musculares.
Abstract
The etiological study of neurogenetic diseases requires molecular diagnosis, for which various genetic analysis techniques that the physician must know, and in turn, this technique must be analyzed by the laboratory considering the clinical guidance. The lack of knowledge of the correlations between the phenotypes and the appropriate tests can lead to diagnostic errors since the wrong technique would not identify the underlying genetic cause, confusing or postponing the diagnosis. A review of molecular biology techniques applied to neurogenetic diagnosis, examples of clinical correlations with specific techniques, and tables with allele types related to diagnostic confirmation are presented. This review is helpful for clinical interpretation and for analysis and reporting of results by laboratories that perform molecular diagnostic tests.
Key words: Molecular Sequence Data. Molecular Diagnostic Techniques. Neuromuscular Diseases. Myopathies, Structural, Congenital. Muscular Dystrophies.
Introducción
El diagnóstico molecular (DM) es la aplicación clínica de tecnologías moleculares para diagnosticar y monitorear enfermedades. Las tecnologías moleculares incorporan tanto el uso de ácidos nucleicos (ADN y ARN) como el uso de anticuerpos recombinantes (1). En neurología el DM establece la etiología de enfermedades neuromusculares y neurodegenerativas, confirmando diagnósticos clínicos, permitiendo el estudio de casos familiares y la instauración de tratamientos específicos (2). Así mismo, el DM es fundamental para la prescripción de algunos medicamentos que dependen del tipo de variante genética del paciente (3) y es una herramienta importante para la farmacogenética, la que permite optimizar la eficacia y minimiza la toxicidad de fármacos de prescripción común (4).
La disponibilidad de DM basado en la secuenciación masiva paralela, del inglés, next generation sequencing (NGS) es la principal herramienta molecular de apoyo al diagnóstico, lo que ha introducido a la práctica clínica conceptos como el panel genético, la secuenciación exómica y el exoma clínico (5). Los resultados de estos estudios implican la interpretación de resultados basados en la evaluación de variantes moleculares que pueden o no tener significado clínico. De otra parte, la NGS tiene limitaciones para detectar mutaciones dinámicas (expansiones o contracciones) así como otros tipos de re arreglos genéticos que incluyen deleciones y duplicaciones. Es así como en la práctica clínica el DM se vale de diversas técnicas de laboratorio que deben ser conocidas por el clínico con el fin de solicitar la prueba adecuada de acuerdo con sospecha clínica (6).
Los objetivos de este articulo son definir los principales términos de aplicación clínica que definen el DM basado en ADN y exponer las técnicas adecuadas de diagnóstico según el tipo de enfermedad neuromuscular sospechada en la evaluación clínica.
Terminología
Secuenciación
La secuenciación del ADN consiste en determinar el orden de los nucleótidos y compararlo con una secuencia de referencia para determinar la presencia de variantes (7). La secuenciación puede ser de un gen completo o de las regiones que codifican para una proteína (exones), en cuyo caso se denomina secuenciación exómica (8). La secuenciación clásica de un solo gen incluye, la secuenciación de exones, de las regiones no codificantes o intrones y las regiones de empalme entre intrones y exones, (sitio de splicing). Usualmente esta secuenciación se basa en amplificar el ADN usando la reacción de polimerasa en cadena (PCR) y luego determinar el orden de los nucleótidos en la muestra amplificada. La técnica más común es la secuenciación de Sanger (9).
La secuenciación NGS no requiere PCR clásica para la amplificación de segmentos . Su aplicación clínica rutinaria, se dirige principalmente a los exones, de tal modo que el uso más común del NGS es la secuenciación exómica de genes de interés o exoma clínico (EC), es decir, la secuenciación exómica de genes relacionados con fenotipos, principalmente monogénicos. A diferencia del EC, la secuenciación exómica completa incluye genes que no necesariamente tiene una relación genotipo-fenotipo definida a la fecha de solicitud del estudio, pero que podrían relacionarse con la presentación clínica del caso de interés (10).
El número de genes analizados en el exoma clínico depende de la plataforma de análisis utilizada, de la capacidad bioinformática de análisis y de los servicios ofrecidos por el laboratorio que ofrece el NGS (11); este número puede oscilar entre 18 000 genes a más de 20 000 genes. La diferencia entre secuenciación de EC y secuencia de exoma completo se hace cada vez más difusa, de tal modo que cada vez se hace más rutinaria la solicitud de exoma completo, del inglés whole exome sequencing (WES). En teoría, el análisis podría extenderse a más de 20 000 genes, teniendo en cuenta que el número de genes de la especie humana no se ha definido con precisión. La última versión de genoma humano (T2T-CHM13), anota 63 494 genes, de los cuales 19 969 se han predicho como genes codificantes de proteínas (12).
Entre más regiones genómicas o mayor número de genes se incluyan en la solicitud del estudio, habrá mayor incertidumbre sobre las relaciones entre ciertas regiones del genoma con fenotipos de interés clínico. La aproximación clínica permite disminuir el número de fenotipos posibles. Por ejemplo, dentro de las enfermedades neuromusculares, reducir clínicamente el fenotipo a un cuadro de miopatía, indica que la etiología genética se circunscribe a los genes conocidos que se asocian al cuadro miopático (13), en ese caso el exoma se reduce a un grupo de genes, o panel genético (14), así, el clínico solicitaría un panel de miopatía. Al panel también se le conoce como un panel o exoma dirigido.
Variantes
Las variantes genéticas encontradas en los genes del EC, del WES, de la secuenciación del genoma completo, del inglés, whole genome sequencing (WGS), o del panel dirigido, pueden estar o no relacionadas con un fenotipo. Las variantes se clasifican así: 1) Patogénica, 2) Probablemente patogénica, 3) Variante de significado incierto o del inglés variable of unknown significance (VUS), (4 Variante probablemente benigna y 5) Benigna (15). Esta clasificación depende de la evidencia que exista sobre la relación de causalidad de la variante con un fenotipo, basado a su vez en evidencia de casos reportados, estudios funcionales del gen, frecuencias alélicas y análisis bioinformáticos (15).
La clasificación reportada en el exoma clínico debe correlacionarse con la clínica. Solo una proporción de las variantes exómicas han sido confirmadas como patogénicas, ya sea a través de estudios clínicos, pruebas funcionales o estudios poblacionales. La amplitud de fenotipos se correlaciona con la proporción de VUS encontradas en múltiples exomas. Por ejemplo, en el caso de estudios dirigidos a causas genéticas de cáncer de ovario y mama, alrededor del 40 % de las variantes identificadas, en panel dirigidos, son VUS (16), en contraste, en las series de pacientes afectados por enfermedades neuromusculares las VUS alcanzan hasta un 53 % (17). El estatus de las VUS puede cambiar con el tiempo, a medida que se correlacionan las variables con los fenotipos. A su vez los fenotipos también varían con el tiempo, haciéndose cada vez más específicos y relacionados con sus bases genéticas (18).
La correlación entre fenotipo y genotipo se actualiza en las bases de datos en donde se consulta el estatus de las variables. El reanálisis del exoma verifica si las variables, como las VUS, cambian de estatus. Por ejemplo, de VUS a probablemente patogénica o a variante patogénica. El reanálisis es una actividad que los proveedores de DM hacen constantemente a partir de recursos bioinformáticos, reporte de comunidades de usuarios (ej. VARSOME) y reportes de la literatura científica, fuentes a partir de las cuales se actualizan bases de datos como Human Gene Mutation Database (HMD), ClinVAR o la base Leiden Open Variation Database (LOVD) (19-21). En la práctica clínica, la solicitud de reanálisis del exoma se hace cada seis a doce meses, dependiendo de la evolución clínica o la presentación de nueva sintomatología (22).
El rendimiento diagnóstico de la secuenciación exómica oscila entre el 25% al 58%, el reanálisis puede incrementar el rendimiento hasta un 12% más (23). El reanálisis es posible porque la tecnología NGS, genera información sobre el exoma del sujeto analizado, la cual se almacena digitalmente y puede ser comparada con bases de datos que actualizan el estatus de las variables (24), así, el reanálisis no requiere en la mayoría de los casos, una nueva toma de muestra.
El rendimiento diagnóstico del DM exómico, se incrementa al realizar el estudio en trio, es decir el exoma clínico del probando y el de sus padres biológicos. Se estima que el rendimiento de NGS es de 34% para un probando, rendimiento que se incrementa entre el 57 % al 86 % al incluir a los padres (25-27). El exoma en trio (ET) permite contrastar las variantes entre el probando y su padres, permitiendo analizar la significancia clínica, la cigosidad y si se trata de variantes heredadas o variantes de novo (28). El análisis de segregación de variantes con el ET también permite dilucidar si una variante de interés está en cis o en trans, situación de especial interés en los casos de heterocigocidad compuesta (29).
Las variables patogénicas puntuales, es decir el cambio de un nucleótido por otro en la secuencia, corresponde a la principal etiología molecular de las enfermedades mendelianas, sin embargo, otros tipos de variantes patogénicas son importantes en la búsqueda etiológica. Los cambios de un solo nucleótido se denominan así: variaciones de un solo nucleótido, del inglés, single nucleotide polymorphism (SNP). La diferencia entre un SNPs y las variantes patogénicas que se asocian a enfermedad (mutaciones) se define por su frecuencia, son SNPs si tienen una frecuencia mayor al 1% en la población, será una variante patogénica si tiene una frecuencia alélica menor al 1% (30).
Los cambios de hasta 50 nucleótidos en un solo locus se denominan, variaciones cortas, que pueden ser una inserción o una deleción (indel) de un conjunto de nucleótidos, mientras que las alteraciones de más de 50 nucleótidos se denominan variantes estructurales, del inglés, structural variations (SV) (31).
Las denominadas variables en el número de copias, del inglés copy number variations (CNVs), son un tipo de variación estructural con cambios en el número de copias de fragmentos de ADN con una longitud superior a 1 Kb (>1 000 nucleótidos) y dan como resultado ganancias (duplicación o transposiciones de inserción), pérdidas (deleción) o reordenamientos complejos (32).
Los SNP y las CV son detectables a través de NGS, algunos algoritmos bioinformáticos pueden detectar CNVs (31). Sin embargo, la detección y caracterización de CNVs debe realizarse a través de otras técnicas, incluyendo la amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples, del inglés, multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) [6], la hibridación genómica comparativa basada en micromatrices, del inglés, microarray based comparative genomic hybridization (aCGH), las micromatrices de polimorfismos de un solo nucleótido, del inglés single polymorphism nucleotide microarrays (SNP microarrays), la secuenciación de ARN [8], la hibridación fluorescente in situ, del inglés Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) [9], los métodos basados en PCR (31) y el southern blot (SB) (33). Estos métodos pueden ser dispendiosos e implican un análisis adicional al análisis NGS, sin embargo, tiene indicaciones especificas según el tipo de enfermedad. Las CNVs pueden analizarse a través de algoritmos informáticos, los cuales tienen limitaciones, relacionadas principalmente con el tamaño de las variantes y la presencia de mosaicismos (31).
Secuenciación genómica
El WES comprende el análisis de entre el 1% al 2% del genoma, pero se estima que contiene aproximadamente el 85% de las variantes que causan enfermedades genéticas (34, 35). Sin embargo, es posible que una mayor proporción de variantes patogénicas este presente en regiones no codificantes, estas regiones genómicas incluyen regiones reguladoras y estructurales, de tal modo que la secuencia del genoma completo abre la posibilidad de detectar la etiología molecular de enfermedades raras, por fuera de los genes codificantes para proteínas (36). La secuenciación tipo WGS, analiza las variantes del ADN al secuenciar tanto las regiones codificantes de proteína como las regiones no codificantes del genoma, incluidos los intrones (36, 37).
La WGS aborda muchas de las limitaciones técnicas del NGS, incluyendo mejor cobertura y mayor sensibilidad para la detección de variantes estructurales y complejas. También permite la identificación de variantes no codificantes, como variantes patogénicas que interrumpen las regiones reguladoras, ARN no codificantes y variantes del splicing del ARN mensajero (38). Sin embargo, al ampliar las regiones analizadas también aumenta la posibilidad de encontrar VUS y disminuye la proporción de variantes asociadas a un fenotipo, de tal modo que la implementación de WGS implicará mayor tiempo en el proceso de validación, análisis bioinformático y un mayor esfuerzo del clínico en relación con la confirmación diagnostica (38).
ADN mitocondrial
Otra fuente de variantes patogénicas con correlación fenotipo-genotipo es el ADN mitocondrial (mt-ADN). La secuenciación mitocondrial (SM) está disponible para uso clínico y complementa el análisis con WES (39). La NGS abarca secuenciación de mt-DNA dirigida, secuenciación de panel, WES y WGS. El estudio más amplio que se realiza rutinariamente en la práctica clínica, en el estudio de enfermedades neuromusculares y neurodegenerativas es el WES con análisis de CNV y secuenciación de mt-ADN (WES+CNV+mt-ADN). En un futuro cercano el WGS remplazara el uso del WES (38).
En la aproximación diagnóstica que incluya la sospecha de enfermedad mitocondrial, se debe tener en cuenta que la disfunción de la organela puede originarse en genes mitocondriales nucleares o en variantes del mt-ADN. Las variantes patogénicas del metabolismo energético se han atribuido a alrededor de 1 500 genes asociados (40). De otra parte el propio mt-ADN tiene múltiples copias por cada mitocondria, de tal modo que las variantes pueden existir en todas las moléculas del mt-ADN (homoplasmia) o en una proporción de la misma (heteroplasmia)(41). Debido a que la replicación del mt-ADN es independiente del ciclo celular y el mt-ADN se puede segregar durante la replicación, los niveles de heteroplasmia son dinámicos y pueden cambiar a lo largo de la vida tanto en células como tejidos mitóticos como posmitóticos (42). Además de la naturaleza de la variante del mt-ADN, el porcentaje de la heteroplasmia es el principal factor que determina la gravedad clínica de la enfermedad (42). Así, el nivel de heteroplasmia del mt-ADN puede variar entre tejidos y cambiar con el tiempo, aspectos que deben tenerse encuentra en la interpretación de resultados de mt-ADN.
Mutaciones dinámicas
Además de las variantes puntuales, SV y las CNVs, una gran proporción de enfermedades neurogenéticas, tiene origen en mutaciones dinámicas asociadas a la expansión de secuencias en tándem en genes particulares. El tándem ocurre, cuando se repite un patrón de uno o más nucleótidos y las repeticiones son directamente adyacentes entre sí (43). La mayoría de estas repeticiones tienen una unidad de repetición de seis o menos nucleótidos y se conocen en inglés como short tandem repeats (STRs) (44). El alelo normal, tiene un rango de repeticiones que no influyen en la fisiopatología de la enfermedad, sin embargo, esta regiones tiene una alta taza de mutación, y son propensas a incrementar el número de repeticiones (45).
En algunas enfermedades, el número de repeticiones no define con seguridad el fenotipo anormal y el rango en que se presenta la repetición se denomina de significancia incierta (43). Se denomina alelo intermedio a un rango de repeticiones en el cual el límite superior del rango esta justo por debajo de un alelo de premutación o del alelo de mutación completa. El alelo de premutación es un alelo inestable que es propenso a expandirse al alelo de mutación completa. Se ha descrito que un número particular de repeticiones del tándem podría ser considerada como patogénica, pero el individuo o individuos de una generación no desarrollan síntomas (46). El alelo de mutación completa es el alelo que constantemente genera la enfermedad (45). El alelo de penetrancia completa implica que a partir de un numero definido de repeticiones no hay penetrancia incompleta y el 100% de quienes tienen el alelo anormal en una generación tienen el fenotipo. Se usan indistintamente los términos, alelo de mutación completa y alelo de penetrancia completa, de tal modo que las repeticiones que cumplan con cada estas definiciones no están definidas con claridad para todas las enfermedades originadas por este mecanismo (45, 46).
La cuantificación de las repeticiones se realiza a partir de diversas técnicas. El SB, ha sido la técnica gold standard para la cuantificación precisa del número de repeticiones de cada alelo (47), sin embargo, es una técnica dispendiosa y que no es de uso rutinario en el laboratorio clínico, de tal modo que se han desarrollado otras técnicas basadas en PCR, como la tpPCR, del inglés, triplet-primed PCR Assay (48) y la PCR fluorescente o combinaciones de ambas técnicas (49), las cuales tienen adecuada correlación con el SB y tienen adecuado rendimiento diagnóstico (50), sin embargo estas técnicas frente al southern se consideran de tamización, dado que pueden distinguir los homocigotos verdaderos y los homocigotos falsos negativos en función de la presencia o ausencia de un patrón de escalera de tripletas expandido. Después de la prueba de tp-PCR, a los pacientes que muestren el patrón expandido se les realizará el southern si se requiere una cuantificación precisa de las repeticiones, el genotipado preciso de los alelos grandes todavía depende del SB (49).
Las técnicas empleadas en el DM son variadas. De acuerdo con el fenotipo o sospecha clínica, la elección del trabajo diagnostico debe tener en cuenta que se necesitan técnicas específicas que están indicadas como primera elección y que el EC o el WES pueden ser pasos posteriores que dependen de los resultados del estudio de tándem o de deleciones y duplicaciones.
A continuación, se describen algunos fenotipos que ejemplifican la necesidad de diversas técnicas de diagnóstico. En la tabla 1 se listan las principales enfermedades neurológicas que tiene como etiología alteraciones en el número de repeticiones en tándem; las tablas 2A y 2B describen las Ataxias espinocerebelosas, del inglés spinocerebellar ataxias (SCAs). En la tabla 3 se describen ejemplos de variantes patogénicas en Atrofia Muscular espinal (AME) y en la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). La tabla 4 señala las mutaciones en PMP22 y ejemplo de sus diferentes fenotipos asociados. En las tablas se especifican las enfermedades y los tándem o repeticiones con que se realiza el diagnóstico, incluidas alelos intermedios, alelos de premutación, mutación completa, alelo de penetrancia reducida, cigosidad y penetrancia completa cuando corresponda.
Enfermedades por expansión o reducción de secuencias en tándem
En este tipo de enfermedades el uso de EC, WES o WGS, no es adecuado para el diagnóstico dado que se requiere determinar el número de expansiones y no cambios o variantes puntuales en la secuencia del gen. En estos casos la solicitud adecuada de estudio es el análisis de la expansión del tándem, no es útil el EC o el WES. Tal es el caso de la enfermedad de Huntington (HD), la atrofia muscular espinal y bulbar (AMEB) y la Atrofia Dentato-rubro-pálido-lusiana (ADRPL), como ejemplos de enfermedades neurodegenerativas secundarias directamente mutaciones dinámicas.
El diagnóstico de HD se establece en un probando con signos y síntomas clínicos de HD mediante la identificación de una expansión de repetición de trinucleótido CAG anormal heterocigota en HTT (Ver tabla 1), la expresión pude ser modulada por factores en cis, como la interrupción CAA en la penúltima repetición [(CAG)n-CAA-CAG]. Las repeticiones CAG ininterrumpidas [(CAG)n] se asocian con menor edad de inicio en la EH y una mayor inestabilidad somática de la repetición (51).
En el caso de la Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) el diagnóstico es primordialmente clínico, y su etiología genética es mixta, encontrando que la expansión del hexanucleótido en C9orf72, se presenta entre el 39% al 45% de los casos familiares y entre el 3% al 7% en casos aislados. A la ELA también se asocian genes de susceptibilidad que incluyen además del C9orf72, otros genes incluidos en paneles NGS dirigidos.
Otros ejemplos de uso mixto de estudios (panel NGS y expansiones) es el estudio del déficit cognitivo ligado a X que incluye más de 100 genes que se estudian a través de paneles, al cual se asocia el estudio de expansión de tripletas para X frágil (FXTAS y FRXE). En el caso de las ataxias, la Ataxia de Friederich es secundaria de la expansión del trinucleótido GAA en estado homocigoto o heterocigoto compuesto, lo que contrasta con las SCAs que pueden desarrollarse por expansión o por variantes patogénicas puntuales, en su mayoría en estado heterocigoto (Ver tablas 2A y 2B). A continuación, se discuten algunos fenotipos y se ejemplifican las pruebas moleculares correspondientes. Paneles con grupos de genes relacionados a fenotipo como ELA, retardo mental ligado a X o SCAs no relacionados con repeticiones, se pueden consultar en el material complementario.
Miopatías y distrofias
El termino miopatía puede se aplica a cualquier enfermedad del músculo, sin embargo, las miopatías congénitas son un grupo de enfermedades clínicamente heterogéneas que tiene en común la presencia de hipotonía y debilidad, generalmente desde el nacimiento, y tienen curso clínico estático o lentamente progresivo. Históricamente, las miopatías congénitas se han clasificado sobre la base de las principales características morfológicas observadas en la biopsia muscular. Sin embargo, se han identificado diferentes genes asociados con las diversas expresiones fenotípicas e histológicas de estos trastornos (52).
La distrofia muscular incorpora una variedad de trastornos hereditarios que conducen a una enfermedad progresiva y generalizada del músculo provocada por glicoproteínas inadecuadas o faltantes en la membrana plasmática de la célula muscular. Usualmente la distrofia tiene mayor gravedad clínica con tiempo de evolución más rápido que la miopatía (53).
Atrofia muscular espinal (AME)
El diagnóstico clínico de la AME se confirma con el estudio del MLPA, dado que en el 95% de los casos la enfermedad se origina en la deleción homocigota del exón 7 del gen SMN1, en el 5% restante se presentan casos de variantes patogénicas puntuales homocigotas o heterocigotas compuestas (54). La técnica de MLPA permite a su vez cuantificar el número de repeticiones del gen parálogo SMN2 (55). El número de repeticiones se correlaciona con las severidad del fenotipo y se requiere de al menos dos copias para que los tratamientos basados en oligonucleótidos antisentido puedan tener efecto terapéutico (56).
Distrofia Muscular de Duchenne/Becker
La Distrofia Muscular de Duchenne Becker (DMD/B) es una miopatía hereditaria, recesiva, ligada a X. Se produce per variantes patogénicas en el gen de la distrofina, principalmente por deleciones (65 al 70 % de los casos), duplicaciones (7 al 18 % de los casos) y alrededor del 10% por variantes patogénicas puntuales (57). Ante la sospecha clínica, la primera línea de diagnóstico es el MLPA, técnica que detecta la mayoría de las deleciones y duplicaciones (58), si el resultado es negativo, pero la clínica sigue siendo sugestiva, está indicada la secuenciación (59). El gen DMD está incluido en paneles NGS de distrofias congénitas. Por tanto, si el MLPA es negativo, se pude solicitar un panel NGS que incluya el gen con el fin de cubrir diagnósticos diferenciales y detectar mutaciones puntuales (58).
En el caso de la DMD el tratamiento depende del tipo de mutación. Ciertas mutaciones tipo deleción son condiciones para el inicio de fármacos basados en mecanismo tipo Exon Skipping (60), mientras que las mutaciones puntuales tipo nonsense son condición para manejo con medicamento tipo Read trhough therapy (Ver tabla 3). Esta consideración implica que el clínico debe tener en cuenta tanto la MLPA como la secuenciación, de otra parte, en el caso de deleciones de un solo exón existe la posibilidad de un falso positivo en la MLPA, dado por la falta de amplificación del exón si hay una mutación puntual que no permita la hibridación de la sonda (61).
Distrofia miotónica
La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad multisistémica que compromete el músculo esquelético y liso, ojos, corazón, sistema endocrino y el sistema nervioso central. La DM1 leve se caracteriza por cataratas y miotonía leve con una esperanza de vida normal (62). La DM1 clásica se caracteriza por debilidad y atrofia muscular, miotonía, cataratas y anomalías de la conducción cardíaca. En la edad adulta se presenta discapacidad física y se compromete la esperanza de vida. La DM1 congénita se caracteriza por hipotonía y debilidad generalizada severa al nacer, asociada con insuficiencia respiratoria y muerte prematura, la discapacidad intelectual es común (63). DM1 es causada por la expansión de tripletas CTG en la región no codificante DMPK (19q13.32). El primer paso en el DM de DM1 es analizar si el paciente tiene dos alelos con un bajo número de repeticiones, lo que pude detectarse mediante PCR convencional y análisis de longitud de fragmentos, esta técnica detecta alelos con 5 a 100 y 100 a 125 repeticiones (64). Si solo se detecta el tamaño de un alelo, se utilizan técnicas, como la TP-PCR, del inglés triplet repeat primed PCR o el SB (49).
El SB es la técnica gold standard principalmente para la detección de alelos de más de 100 repeticiones, sin embargo, es una técnica dispendiosa que no está disponible en la mayoría de los laboratorios diagnósticos (65). También se tiene como alternativa el LR-PCR, del inglés long-range PCR, que se aplica a fragmentos que normalmente no se pueden amplificar utilizando métodos o reactivos de PCR de rutina (66). Las polimerasas LR-PCR amplifican hasta 30 kb o más. La técnica más utilizada en la clínica es la TP-PCR que es más sensible que el SB y de mayor facilidad de ejecución (65).
La distrofia miotónica tipo 2 (DM2) se caracteriza por miotonía y debilidad de predominio proximal y axial, asociado a cataratas, defectos de conducción cardíaca y diabetes mellitus tipo 2. El diagnostico se confirma por la expansión patogénica de la repetición CCTG dentro de un patrón o motivo de repetición complejo, (TG)n(TCTG)n(CCTG)n en el gen CNBP (64). En el caso de la DM2 se utilízala misma aproximación molecular que en DM1. Es claro que tanto para la DM1 y la DM2, el diagnostico no se alcanza con WES, ni con WGS dado que ninguna de estas técnicas detecta el número de expansiones de una mutación dinámica (67) (Ver Tabla 1).
Distrofia oculofaríngea
La distrofia muscular oculofaríngea (DOF) se caracteriza por ptosis palpebral y disfagia debido a la afectación de los músculos de párpados y faringe (68). El diagnóstico se establece si se presenta una expansión de la repetición del trinucleótido GCN heterocigoto de 11 a 18 repeticiones en el primer exón de PABPN1 (~90 % de los individuos afectados) o expansiones de repetición de trinucleótidos GCN bialélicos que son compuestos heterocigotos GCN con un segundo alelo expandido u homocigotos (GCN[11]+[11], GCN[12]+[12], GCN[13]+[13], etc.) (~10% de los individuos afectados) (69). La repetición GCN es compleja, siendo N = A, T, C o G. La secuenciación de Sanger se usa típicamente para determinar la longitud y la cigosidad de las repeticiones de GCN; sin embargo, debido a la secuencia y el tamaño de la repetición, también se puede utilizar la secuenciación de próxima generación (NGS) o el análisis de fragmentos (70).
Distrofia fascio-escapulohumeral
La distrofia muscular de facioscapulohumeral (DFEH) es una enfermedad genética con un patrón de herencia autosómica dominante que afecta grupos musculares que incluyen los de la cara, la cintura del hombro (escapulohumeral) y las extremidades inferiores, con afectación usualmente asimétrica (71). La DFEH es el resultado de una interacción compleja que involucra el producto proteico del gen Dux4 (activador transcripcional PITX1) ubicado en la región subtelomérica D4Z4 (4q), la reducción de repeticiones D4Z4, la presencia de haplotipos permisivos, además de variantes patogénicas y alteraciones en el patrón de la metilación de D4Z4, regulados por los genes SMCHD1 y DNMT3B (72) (Ver tabla 1).
En relación con D4Z4, esta se trata de una gran estructura de repetición polimórfica que consta de 1 a 100 unidades KpnI , estas unidades tienen cada una de 3.3 kb de tamaño, y muestran muy poca diversidad de secuencias (73). Los haplotipos permisivos de D4Z4 tienen una región pLAM que alberga una señal de poliadenilación para las transcripciones de la unidad D4Z4 que está en la posición más telomérica, los haplotipos permisivos son: 4A161, 4A159, 4A168, 4A166H, los no permisivos (sin la señal de poliadenilación) son los alelos 4A166, 4B (74). El alelo normal de D4Z4 tiene ≥12 unidades repetidas (es decir, fragmentos de ≥43 kb usando EcoRI y la sonda p13E-11), o un locus D4Z4 con cualquier número de unidades repetidas en un haplotipo no permisivo (75). Los alelos contraídos de penetrancia reducida tienen un locus D4Z4 que tiene diez u 11 unidades repetidas y está en un haplotipo permisivo; el alelo de penetrancia completa es un locus de D4Z4 que tiene nueve o menos unidades y está en un alelo permisivo (75).
Existen cuatro mecanismos de desarrollo de la enfermedad. La DFEH tipo 1 (~95% de los casos), se presenta por una contracción heterocigota de la repetición D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35 en un haplotipo permisivo. La DFEH tipo 2 (~5% de los casos) se presenta por hipometilación de la matriz de repetición D4Z4 en la región subtelomérica del cromosoma 4q35 en un haplotipo permisivo como resultado de una variante patogénica (o probablemente patogénica) heterocigota en el gen SMCHD1 (~85 % de las personas con DFEH tipo 2), por una variante patogénica (o probablemente patogénica) heterocigota en el gen DNMT3B o por otra causa no conocida de hipometilación del D4Z4.
Es claro que para completar el diagnóstico de la DFEH se deben involucrar diversas técnicas. Las pruebas genéticas moleculares para determinar la longitud o el número de unidades repetidas del locus D4Z4 se basa en el análisis de transferencia Southern, con una sonda (ej., p13E-11) inmediatamente proximal a D4Z4. Las pruebas de diagnóstico de electroforesis en gel lineal y análisis de transferencia Southern utilizan la enzima de restricción EcoRI, que reconoce el locus D4Z4 en los cromosomas 4 y 10. La electroforesis en gel de campo pulsado y el análisis de transferencia Southern requieren digestión doble EcoRI/HindIII para una mejor resolución de fragmentos de ADN entre 20 y 50 kb. Una doble digestión con EcoRI/BlnI fragmenta también el tándem D4Z4 del cromosoma 10, lo que permite distinguir las matrices D4Z4 ubicadas en el cromosoma 4 de las matrices benignas similares en el cromosoma 10 (76). El análisis de haplotipos permisivos debe tener en cuenta que 4A161 es el haplotipo permisivo más frecuente. Todos los pacientes con DFEH portan un haplotipo permisivo. Debido a que hasta el 66 % de los controles también tienen un haplotipo permisivo, este análisis sin el número de repeticiones D4Z4 no es informativo, por tanto, se debe realizar tanto el análisis de repeticiones D4Z4 y el análisis de haplotipo permisivo. Se ha desarrollaron una prueba de diagnóstico para discriminar ambas variantes del haplotipo utilizando enzima HindIII y sondas específicas para 4A (permisivos) y 4B (no permisivos)(77, 78).
Los valores de metilación de D4Z4 por debajo del umbral del 25 % son indicativos de FSHD. Sin embargo, la metilación de CpG en D4Z4 también está determinada por su tamaño. Las repetición D4Z4 contraídas en los cromosomas tienen un nivel de metilación significativamente más bajo que las matrices de tamaño normal, por tanto, los niveles de metilación de D4Z4 deben evaluarse con respecto al tamaño de repetición. Un método basado en SB mide la metilación total de D4Z4 mediante el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (FseI) en la región promotora de DUX4 (79) La metilación promedio de D4Z4 en los individuos de control es del 45 %, mientras que en los individuos con FSHD2 el nivel de metilación cae por debajo del 25 %, con un promedio del 11 % (79).
Neuropatías periféricas
En el caso del gen PMP22 se presenta un situación particular de heterogeneidad alélica. El fenotipo Charcot-Marie-Tooth (CMT) engloba un conjunto de neuropatías hereditarias caracterizados por una polineuropatía motora y sensitiva crónica (80). En general, los tipos de neuropatía autosómica dominante tipo CMT se basan en el estudio de velocidad de neuroconducción (VNC) (VNC: normal >40-45 metros/segundo), generando tres grupos de enfermedad: desmielinizante (CMT 1) definido como VNC <35 m / s., axonal (no desmielinizante) (CMT 2) definido como VNC >45m/s y CMT intermedia dominante (DI-CMT) definida como CMT intermedia dominante (DI-CMT) NCV 35-45 m/s (81). En el caso de la CMT 1A, esta se produce por la duplicación o variantes patogénicas del gen (PMP22) que codifica la proteína-22 de mielina periférica (82); otro grupo de variantes patogénicas puntuales en el mismo gen generan el fenotipo CMT 1E, que se asocia a sordera (83). En contraste las deleciones en PMP22 generan la neuropatía hereditaria con susceptibilidad de parálisis por presión (NHSPP), a su vez otros alelos patogénicos en PMP22 o en MPZ generan la distasia arrefléxica de Roussy Levy (83, 84), así mismo otras variantes puntuales en PMP22, PRX y EGR2 causan el fenotipo Dejenire Sotas también conocido como CMT 3 (85). El conjunto completo de CMT implica alrededor de 80 genes, por tanto, la aproximación clínica debe tener en cuenta la utilidad del MLPA, útil para CMT 1A y NHSPP, mientras que la secuenciación sería útil en los casos Roussy Levy y Dejenire Sotas. El panel NGS incluye varios genes incluidos los mencionados, pero cabe recordar que la NGS no es la técnica adecuada para la detección de indels.
Conclusiones
Se presentan ejemplo cincos de patologías neurológicas con heterogeneidad alélica que ameritan la selección adecuada de pruebas diagnósticas. La solicitud de pruebas genéticas en el campo de las enfermedades neurologías implica un conocimiento básico de las bases genéticas y moleculares de la enfermedad. El especialista debe conocer los fundamentos de las técnicas y sus indicaciones de acuerdo con los fenotipos clínicos, de otra peerte el laboratorio de diagnóstico molecular debe tener la capacidad de ofrecer diversas técnicas de análisis para satisfacer las necesidades diagnósticas. Así mismo, el laboratorio debe informar al médico solicitante las posibilidades de análisis ante fenotípicos específicos que no se detectan mediante análisis de secuenciación.
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Anexo
Genes asociados a la ELA: ABCD1, ABHD12, ALS2, ANG, ARHGEF28, CHCHD10, CHMP2B, CRYM, DAO, DCTN1, ERBB4, FIG4, FUS, GRN, HNRNPA1, HNRNPA2B1, LUM, MAPT, MATR3, NEFH, NEK1, OPTN, PFN1, PRPH, PSEN1, SETX, SIGMAR1, SOD1, SPART, SPG11, SQSTM1, TAF15, TARDBP, TBK1, TREM2, TRPM7, TUBA4A, UBQLN2, UNC13A, VAPB, VCP, VEGFA).
Genes relacionados con retardo mental ligado a X: ABCD1, ACSL4, AFF2, AGTR2, AIFM1, AP1S2, ARHGEF6, ARHGEF9, ARX, ATP6AP2, ATP7A, ATRX, BCOR, BRWD3, CASK, CCDC22, CDK16, CDKL5, CLCN4, CLIC2, CNKSR2, CUL4B, DCX, DKC1, DLG3, DMD, EBP, EIF2S3, FAAH2, FANCB, FGD1, FLNA, FMR1, FRMPD4, FTSJ1, GDI1, GK, GPC3, GRIA3, GSPT2, HCCS, HCFC1, HDAC8, HPRT1, HSD17B10, HUWE1, IDS, IGBP1, IL1RAPL1, IQSEC2, KDM5C, KLF8, L1CAM, LAMP2, LAS1L, MAGT1, MAOA, MBTPS2, MECP2, MED12, MID1, NAA10, NDP, NDUFA1, NEXMIF, NHS, NLGN3, NLGN4X, NSDHL, OCRL, OFD1, OGT, OPHN1, OTC, PAK3, PCDH19, PDHA1, PGK1, PHF6, PHF8, PLP1, PORCN, PQBP1, PRPS1, PTCHD1, RAB39B, RBM10, RPL10, RPS6KA3, SHROOM4, SLC16A2, SLC9A6, SMC1A, SMS, SOX3, SRPX2, SYN1, SYP, TAF1, THOC2, TIMM8A, TSPAN7, UBE2A, UPF3B, USP9X, WDR13, ZC4H2, ZCCHC12, ZDHHC9, ZMYM3, ZNF41, ZNF674, ZNF711, ZNF81.
Genes relacionados con ataxias de inicio temprano: ABCB7, ABHD12, ACO2, AFG3L2, AHI1, ALDH5A1, ALS2, ANO10, APTX, ARL13B, ATCAY, ATL1, ATM, ATP8A2, B9D1, BBS1, BBS12, BSCL2, C12orf65, C19orf12, CA8, CAMTA1, CC2D2A, CEP290, CEP41, CLCN2, CLN5, CLPP, COQ2, COQ6, COQ8A, COQ9, COX20, CPLANE1, CSTB, CWF19L1, CYP27A1, CYP7B1, DNAJC19, EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4, EIF2B5, FA2H, FBXL4, FGF14, FLVCR1, FXN, GALC, GBA2, GFAP, GJC2, GOSR2, GRID2, GRM1, GSS, HEPACAM, INPP5E, ITPR1, KCNA1, KCNC3, KCND3, KCNJ10, KIF1A, KIF1C, KIF5A, KIF7, LAMA1, MLC1, MRE11, MTPAP, NDUFS1, NDUFS7, OFD1, OPA1, OPA3, OPHN1, PAX6, PDSS1, PDSS2, PEX10, PEX7, PHYH, PLP1, PNKD, PNKP, PNPLA6, POLG, POLR3A, POLR3B, PRKCG, PRRT2, RORA, RPGRIP1L, RRM2B, RUBCN, SACS, SETX, SIL1, SLC16A2, SLC1A3, SLC2A1, SLC52A2, SLC52A3, SLC9A6, SNX14, SPAST, SPG11, SPR, SPTBN2, STUB1, TCTN1, TCTN2, TCTN3, TDP1, TGM6, TMEM216, TMEM231, TMEM237, TMEM240, TMEM67, TPP1, TTPA, TUBB4A, TWNK, TYMP, VAMP1, VLDLR, WDR73, WDR81, WFS1, WWOX, ZNF423.
Genes relacionados con ataxias de inicio tardío: ABHD12, AFG3L2, ALS2, ANO10, APTX, ATL1, C19orf12, CACNA1A, CACNB4, CCDC88C, CLCN2, CYP27A1, CYP7B1, DNMT1, EEF2, EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4, EIF2B5, ELOVL4, ELOVL5, FGF14, FMR1, FXN, GFAP, ITM2B, ITPR1, KCNC3, KCND3, KIF5A, NOL3, NOTCH3, PDYN, PEX7, PHYH, POLG, PRKCG, RORA, RRM2B, SETX, SLC1A3, SPAST, SPG11, SPG7, STUB1, SYNE1, SYT14, TGM6, TMEM240, TTBK2, TTPA, TUBB4A, TWNK, TYMP, VAMP1, WASHC5.
Genes relacionados con expansiones en SCAs: ATN1, ATXN1, ATXN10, ATXN2, ATXN3, ATXN7, ATXN8OS, BEAN1, CACNA1A, FMR1, FXN, NOP56, PPP2R2B, TBP.